Q1:為什麼我在定序報告上找不到我的 Primer 序列 ?
Q2:我按照你們所說的方式都找過了,還是沒有,你們給我的結果完全不是我要的序列!
Q3:那就是說我要再給你們一次 Sample 囉 ?
Q4:你們給我的序列怎麼在一串後就沒有信號了?
Q5:你們給我的結果怎麼會有那麼多錯誤! 這堜明有一個A/G/C/T為什麼沒有讀出來?
Q6:我的圖和文件都遺失了, 可不可以再給我一次?
Q7:你們提供的磁碟/CD堻ㄛO些亂七八糟的文件, 一個都打不開!?
Q8:可不可以將我的樣品在700 bp 以後的序列也一併印出來給我?
Q9:我要求 5' 端到 3' 端的正向定序, 為什麼你們給我的序列是反的?
Q10:我的樣品你們已經定序完成了, 但是為什麼在Overlap區有很多錯誤?
Q11:我有一個4kb 的PCR product, 希望你們幫我做定序…
Q12:你們給我的報告上註明 "Deletion" (缺失) 是什麼意思?
Q13:我的樣品上有一個雜合子 (Heterozygote), 為什麼在報告上看不到?
Q14:你們常提到並列 (Two pattern), 什麼是並列?
Q15:為什麼我早上打電話來詢問結果的時候你們總是說結果還沒好?
Q16:你們說三個工作天送結果, 怎麼我上週五送的樣品, 到今天週二了還沒收到結果?
Q17:失敗的樣品要如何收費?
Q18:為什麼我的Clone雙向定序卻只在一端發現了PCR primer sequence?
           為什麼你們定出來的序列和我接進去的片段大小不一樣, 雖然上/下游引子都已經找到?
           為什麼在我的Insert會出現一段#$%& 序列, 完全和我的實驗無關? 為什麼….? 為什麼….?

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Q1:為什麼我在定序報告上找不到我的Primer 序列?

A:    這堣嬤熇堭〞p:

一是找不到定序時使用的primer序列。這是正常的, 因為螢光定序方法採用的是螢光標記的ddNTP, 自動定序儀通過偵測ddNTP 上的螢光來判讀序列。由於引子本身不會被標記, 所以在定序報告中也是找不到的。

二是找不到插入片段上的primer。發生這種情況原因可能是您在構建(Construct) 質體 (Plasmid) 時採用的限制酶的限制切點離您所選擇的定序用引子太近, 由於螢光染料的干擾, 在序列開始的部分 (約30 –50 bp) 會不太準確, 這媮|例說明: 假設您使用 pBC KS 這個plasmid, 採用Sac I 限制酶, 並用 T7 promotor 做primer進行定序:

TGTAAAACGACGGCCAGTGAGCGCGCGTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAAC…                            M13 F                                                       T7 Promoter                                   Sac I                                 Not I          Xho I

這堨i以看見從T7 promoter末端到 Sac I 的限制酶切位點只有6 bp, 這樣很容易導致酶切位點後的primer序列在定序報告上不完整。解決的辦法是採用M13 F primer來進行定序, 這樣可以保證Apa I的位點和之後的primer序列都可以完整的看到。或者如果可行的話, 選另外一個限制酶 (Not I 或Xho I, 當然, Xho I 的效果可能會好些) 來切也可以解決這個問題。 當然還有一種可能是您的插入片段的插入方向是反的, 這時您不妨找一下您primer的互補序列。

Q2: 我按照你們所說的方式都找過了, 還是沒有, 你們給我的結果完全不是我要的序列!

 A:    像這種情況只有兩種可能性:

一是我們給您的定序結果對應的不是您的樣品, 二是您的樣品的insert與您預期的不一致。

關於第一種狀況, 我們可以再做一次實驗以確認送交給您的定序報告和您的樣品是否相符。其方法是取您原始的樣品重新養菌後再進行一次定序反應。如果所得出的報告與前一次不同, 則表示我們在樣品流程管制上可能有缺失, 為了表達歉意, 前後兩次的定序反應都免費。但如果得出的報告與前一次相同, 則表示我們在整個流程上並沒有疏失, 則兩次的定序費用都要向您收取。

至於後者的狀況, 很抱歉, 我們並沒有能力去確認您的insert是否符合您的預期。我們唯一能做的是, 提供您一個正確的定序結果。

 

Q3:   那就是說我要再給你們一次Sample囉?

 A:     不, 我們將用第一次定序結果的Template 再做一次定序。但若Sample已經送還給您, 那我們就無法確認了。

 

Q4: 你們給我的序列怎麼在一串A/G/C/T後就沒有信號了?

 A:    以目前的螢光定序方式來說, 在重複序列後的訊號讀取問題是一個瓶頸。而且至今都還沒有什麼很好的方式可以保證在Poly A/G/C/T後面有很好的結果 (雖然有過成功的經驗)。

          我們目前的原則是這樣: 如果樣品是plasmid DNA, 那麼當存在30個以上的Poly T/A時, 無論之後的信號質量如何, 我們都會將結果印出來, 且視為成功定序並送交客戶。而當樣品是PCR product 時, 這個限制的長度是15個bp 。相對於Poly A/T, Poly G/C 的影響會更大。無論在何種定序Template上只要出現連續10個G/C, 我們都會將結果送到您手上。

          由於這樣的重複序列對定序結果的影響是絕對的, 所以請您在選擇primer時盡量避開有重複序列的一端。

 

Q5: 你們給我的結果怎麼會有那麼多錯誤! 這堜明有一個A/G/C/T為什麼沒有讀出來?

 A:    基本上定序結果只是一個參考值, 真正的序列應該是多次定序累加後的結果。通常定序結果的前端30個bp由於會受到螢光染料的干擾, 可能會存在錯誤, 為保證您能夠得到完整的目的序列, 請您在選擇定序primer時務必謹慎; 序列的可靠程度則視圖譜上 peak的質量而定, 我們通常提供500bp左右的有效結果。自動定序儀解讀序列的準確性並非100%, 雖然經過我們技術人員的檢查, 還是有可能會有錯讀或漏讀的情況發生, 要達到100%的準確性只有進行不同方向的多次定序。

 

Q6: 我的圖和文件都遺失了, 可不可以再給我一次?

 A:    當然可以, 不過由於保密原則的關係, 我們的定序結果只保留三個月, 而樣品只保留一個月, 所以請您無論是要追加後續實驗或是重新印送結果都請您儘早通知。

 

Q7: 你們提供的磁碟/CD堻ㄛO些亂七八糟的文件, 一個都打不開!?

 A:    這個嘛, 其實對您真正有用處的文件都是以 “.ab1” 做結尾的文件。而以 “.seq” 做結尾, 大小僅1-2 kB 的文件只是序列文件, 直接使用編輯器 (如MS-Word, Notepad) 等就可以讀取, 但是堶捷含有您樣品的序列而已。另外一個大小在 100 kB 以上的文件是定序圖譜, 要使用專門的軟體才能讀取。在此我們我們提供的是 Chromas 這個軟體, 功能很強大。它所能提供的訊息量比印出來的定序圖要多很多。當您第一次送樣品給我們定序時我們都會提供這個軟體給您, 所以您想讀取這些文件時不妨找一下我們第一次送結果回去時隨結果附上的Floppy Disk 或是CD。如果沒有也可以告訴我們, 我們會盡快為您送上。

 

Q8: 可不可以將我的樣品在700 bp 以後的序列也一併印出來給我?

 A:    由於我們在確認定序結果時的原則是進行到650 bp 之後的序列即不再檢查, 也不認為其準確。所以這樣的序列也不列印。如果您需要這部份的序列, 可以從我們提供給您的結果檔案中擷取。

 

Q9: 我要求 5’ 端到 3’ 端的正向定序, 為什麼你們給我的序列是反的?

 A:    您指的可能是insert 段的方向, 而我們並不清楚您的樣品是如何construct的。我們只能根據plasmid上的序列來確定sequence方向, 所以在定序引子一欄中請不要用 “ 3’ Primer” 和 “ 5’ Primer”這樣的字眼, 因為我們手中的資料在註明方向時可能和您手中的資料方向相反, 所以請您用 T7, T3, SP6, M13F… 等等的形式來填寫, 或註明Restriction site 方向, 例如 “定序方向 EcoR I 到 Hind III” 也可以。因為我們手中的plasmid資料有限, 有時還是需要您提供plasmid的相關資料。

 

Q10: 我的樣品你們已經定序完成了, 但是為什麼在Overlap區有很多錯誤?

 A:    我們送交給您的全序列結果 (Full Sequence Data) 是一個拼接的結果, 當互相拼接的兩個序列存在差異時, 應該以序列質量較好的為主, 這也是為什麼會出現全序與單一定序結果的差異。 

通常在 Overlap的位置都會有一段序列是位於500 bp可靠範圍內的, 我們在拼接全序列時也會以500bp 之內的信號為準, 但這也並不是絕對的。

舉上圖為例, 正向在310bp處有兩個C的信號, 而反向在與其對應的579bp處卻只有一個G的信號。這時就不能單純以500bp內的信號為準。如果您的結果中發現了這樣的問題, 請儘速與我們聯繫, 我們會重新進行定序以確認結果。

 

Q11: 我有一個4kb 的PCR product, 希望你們幫我做定序…

 A:    基本上, 大於2kb的PCR product 要完全定序最好還是循cloning 的方式 construct 好 plasmid 再進行定序工作。這樣template 會更加穩定, 定序效果也會更好。當然, 這只是我們的建議, 實際進行方式我們會先與您討論後再進行。

 

Q12: 你們給我的報告上註明 “Deletion” (缺失) 是什麼意思?

 A:    Deletion 和並列的情況十分相近。區別在於並列的干擾是無規律的干擾, 而deletion這種狀況是有規則可循的。

 

                如上圖就是一個典型的缺失圖譜。我們可以看到從120bp處開始出現, 大約是有4 bp 的deletion。

            這種情況發生於 PCR product 中比較多, 特別是從Tissue或Whole blood 這種Mixture Template 中得到的PCR product , 往往會有很多Heterozygote 或Deletion。在 Plasmid DNA 中這種情況極少出現, 但的確也會發生。當發生此種情況時, 有些樣品重新挑 single colony後就可以排除, 但有些重新挑過後狀況依舊, 至於後者情況出現的原因, 很抱歉, 我們目前還無法回答這個問題。

 

Q13: 我的樣品上有一個雜合子 (Heterozygote), 為什麼在報告上看不到?

 A:    在檢查結果時, 無論是儀器本身和我們的技術人員都傾向於提供給客戶一個單一的信號, 所以在出現 Heterozygote 的位點上所列出的信號往往是比較強的一個信號。所以您的PCR product 上是存在Heterozygote 的, 請在定序訂購單上註明, 我們在檢查結果時會加以注意。

           但如果在您預期出現 Heterozygote的位點上只有單一信號時, 那麼我們是不會 (也無法) 將其修改為Heterozygote的。這種情況可能是您的樣品中Heterozygote成份太少, 以致信號太弱無法被偵測到。

 

Q14: 你們常提到並列 (Two pattern), 什麼是並列?

 A:    像下圖就是一個典型的並列的結果。

 

         從圖中可以看到在同一個鹼基的位置上出現兩個不同的peak, 這樣的狀況就是並列。導致這種現象的可能原因如下: 

1.        樣品本身被污染。通常發生於樣品為plasmid和菌液的狀況下。當使用 universal primer定序時, 如果剛好和樣品中的幾種質體均能結合, 那麼就會出現這種情況, 而且在同一位置上還可能有不止兩個peak。 

2.       樣品不是單一模版, 通常發生於樣品為PCR product 時。由於使用的是specific primer, 因此即使 Template 中有其它的DNA, 產生干擾的可能性也很小。通常是由於存在兩條分子量很接近, 近到用 Agarose Gel都無法分開時, 就很容易發生這種情況。 

3.       樣品中存在兩個primer binding site。通常發生於樣品中存在重複序列 (Repeat Sequence) 的狀況下。當primer 正好設計在重複序列中時, 那麼重複序列以外的部份就會出現並列的情況。

 

Q15: 為什麼我早上打電話來詢問結果的時候你們總是說結果還沒好? 

A:     上午是我們實驗最繁忙的一段時間, 每位客戶都很關心自己樣品的情況, 但我們的工作人員在追蹤您樣品進度的同時, 其它客戶的樣品進度或結果必然受到影響。每位客戶都不希望這樣的延誤發生在自己身上。所以, 我們誠摯的希望您能儘量在下午來電詢問您的進度或結果。

  

Q16: 你們說三個工作天送結果, 怎麼我上週五送的樣品, 到今天週二了還沒收到結果? 

A:     我們是從收到樣品的當天開始計算, 而且週末休息。所以很可能週二是第二個工作天而已。我們三個工作天的承諾是保證在這段時間內儘可能地提供您最終的結果, 如果無法得到結果, 我們也會在時限到之前與您聯絡。

 

Q17: 失敗的樣品要如何收費? 

A:    請見此處說明 

 

Q18: 為什麼我的Clone雙向定序卻只在一端發現了PCR primer sequence? 為什麼你們定出來的序列和我接進去的片段大小不一樣, 雖然上/下游引子都已經找到? 為什麼在我的Insert 會出現一段 #$%& 序列, 完全和我的實驗無關? 為什麼….? 為什麼….?

 A:    很抱歉, 這些問題我們真的一個也無法回答, 因為已經超出了我們的能力範圍。我們僅僅只是您整體實驗中的一個環節, 能夠做的僅是向您提供一個準確的定序結果。但如果您有任何實驗上的問題, 我們觀迎您與我們討論, 我們將儘可能地解決您的問題。